Preparación de Soluciones para SDS-PAGE para Proteínas

OBJETIVO

Es continuar con el protocolo para realizar una PAGE-SDS, hoy procedemos realizar la preparación de la muestra y en dejar listo el Buffer de proteínas.

MATERIAL

• Eppendorff
• Glicina 2.5g
• 5 mL SDS 20% 
• Tris-CIH 1mL
• Vaso de precipitados
• Agua ultrapura
• Agitador magnético
• Centrífuga
• 50 microlitros de betamercaptoetanol
• Suero humano
• TCA 20%
• TCA 5%
• Acetona
• Pipetas, puntas y prepipetas

PROCEDIMIENTO

- Buffer de proteínas:

1. Pesar la Glicina y medir el volumen de 5mL SDS 20% y 1mL Tris-ClH.

2. Echar todo en un vaso de precipitados. 

3. Añadir agua hasta llegar aproximadamente 8,5ml. 

4. Agitar en el agitador magnético.

5. Cuando esta disuelto lo enrasamos a 9,5ml con agua. 

6. Lo alicuotamos en tubos eppendorf a 0,95 ml por tubo. 

7. Etiquetamos.

8. La profesora añade 50 microlitros de betamercaptoetanol a cada tubo, en la campana.

9. Guardar a -20ºC.

- Preparación de la muestra:

1. Un rato antes programamos la centrifuga para que esté a 4ºC cuando la necesitemos.

2. Pipeteamos 100, 300 y 500 microlitros de suero humano.

3. Lo transferimos a tubos tipo eppendorfs.

4. Añadimos 1mL de TCA 20% 4ºC, agitamos por inversión.

5. Centrifugamos a max rpm en la microcentrífuga a 4ºC durante 10 min.

6. Eliminamos sobrenadante por inversión.

7. Añadimos 0.5 mL de TCA 5% 4ºC

8. Centrifugamos a max rpm-a con la microcentrífuga  a 4ºC durante 5 min.
9. Eliminar el sobrenadante pipeteando con cuidado de no mover el pellet.
10. Añadimos 300 microlitros de acetona -20ºC.
11. Centrifugamos a max rpm en la centrífuga a 4ºC durante 5 min.
12. Eliminamos la acetona y dejamos secar el pellet a temperatura ambiente.
13. Resuspendemos el pellet en 50 microlitros de agua.
14. Añadimos 5 microlitros de Loading Buffer 5x.
15. Congelamos la muestra hasta su uso.

OBSERVACIONES

 Al no disponer de una mosca tan pequeña para nuestro volumen se agita con cuidado con una varilla. 
En el protocolo hay algunas modificaciones en las cantidades que hemos ido añadiendo al eppendorff con el fin de mejorar la práctica lo máximo posible.