Electroforesis Vertical SDS-PAGE

OBJETIVO

Adquirir conocimientos sobre como realizar correctamente una electroforesis vertical de SDS-PAGE.

MATERIALES

• Fuente de electroforesis
• Pipetas 
• Tampón de electroforesis
• Marcadores preteñidos de peso molecular
• Tampón de carga

PROCEDIMIENTO

1. Tras haber hecho los reactivos en la anterior práctica, añadimos tampón de carga a las muestras.

2. Colocamos los geles en el soporte de la cubeta y añadimos el tampón.

3. Mientras preparamos la cubeta con el tampón, ponemos a calentar agua en un vaso de precipitados, lo tapamos con papel de aluminio y metemos los tubos eppendorf para calentar la muestra durante un par de minutos.

4. Cogemos la pipeta y vamos cargando los pocillos con cuidado de no salirnos y romper el gel.

5. Cargamos el gel, mientras vamos anotando qué estamos cargando en cada pocillo.

6. Una vez cargado conectamos el gel a la fuente de alimentación y lo ponemos a 80 V y después lo subimos a 120 V.

7. Cuando la escalera haya corrido más de la mitad del gel ( unas dos horas y cuarto) apagamos la corriente.

8. Separamos las placas de vidrio con ayuda de una espátula para sacar el gel, con cuidado de no invertir su orientación. 

9. Una vez finalizada la transferencia, se tiñe el gel de electroforesis mediante su inclusión en solución de tinción que contiene Azul de Coomassie, ácido acético glacial e isopropanol, durante 2 horas a temperatura ambiente. 

10. Posteriormente, se pasa el gel a solución de distinción que contiene ácido acético 8% y etanol 25% en agua, destiñendo el gel durante toda la noche.

Resultado de electroforesis

OBSERVACIONES

La mayoría de las proteínas de suero se han quedado muy cerca del pocillo, por lo se debería habe dejado más tiempo o usado un gel de concentración menor.

Preparación de Soluciones para SDS-PAGE para Proteínas

OBJETIVO

Es continuar con el protocolo para realizar una PAGE-SDS, hoy procedemos realizar la preparación de la muestra y en dejar listo el Buffer de proteínas.

MATERIAL

• Eppendorff
• Glicina 2.5g
• 5 mL SDS 20% 
• Tris-CIH 1mL
• Vaso de precipitados
• Agua ultrapura
• Agitador magnético
• Centrífuga
• 50 microlitros de betamercaptoetanol
• Suero humano
• TCA 20%
• TCA 5%
• Acetona
• Pipetas, puntas y prepipetas

PROCEDIMIENTO

- Buffer de proteínas:

1. Pesar la Glicina y medir el volumen de 5mL SDS 20% y 1mL Tris-ClH.

2. Echar todo en un vaso de precipitados. 

3. Añadir agua hasta llegar aproximadamente 8,5ml. 

4. Agitar en el agitador magnético.

5. Cuando esta disuelto lo enrasamos a 9,5ml con agua. 

6. Lo alicuotamos en tubos eppendorf a 0,95 ml por tubo. 

7. Etiquetamos.

8. La profesora añade 50 microlitros de betamercaptoetanol a cada tubo, en la campana.

9. Guardar a -20ºC.

- Preparación de la muestra:

1. Un rato antes programamos la centrifuga para que esté a 4ºC cuando la necesitemos.

2. Pipeteamos 100, 300 y 500 microlitros de suero humano.

3. Lo transferimos a tubos tipo eppendorfs.

4. Añadimos 1mL de TCA 20% 4ºC, agitamos por inversión.

5. Centrifugamos a max rpm en la microcentrífuga a 4ºC durante 10 min.

6. Eliminamos sobrenadante por inversión.

7. Añadimos 0.5 mL de TCA 5% 4ºC

8. Centrifugamos a max rpm-a con la microcentrífuga  a 4ºC durante 5 min.
9. Eliminar el sobrenadante pipeteando con cuidado de no mover el pellet.
10. Añadimos 300 microlitros de acetona -20ºC.
11. Centrifugamos a max rpm en la centrífuga a 4ºC durante 5 min.
12. Eliminamos la acetona y dejamos secar el pellet a temperatura ambiente.
13. Resuspendemos el pellet en 50 microlitros de agua.
14. Añadimos 5 microlitros de Loading Buffer 5x.
15. Congelamos la muestra hasta su uso.

OBSERVACIONES

 Al no disponer de una mosca tan pequeña para nuestro volumen se agita con cuidado con una varilla. 
En el protocolo hay algunas modificaciones en las cantidades que hemos ido añadiendo al eppendorff con el fin de mejorar la práctica lo máximo posible.

Valoración Ácido-Base

OBJETIVO

Poner en práctica un valoración y a la vez ir entendiendo la parte teórica del procedimiento.

MATERIAL

• Embudo
• Bureta con soporte
• Vaso de precipitados
• NaCl 0.5M
• Ácido de concentración desconocida 25mL
• Fenoltaleína

PROCEDIMIENTO

1. Colocamos 25mL de NaCl al 0.5M en la bureta.

2. Colocamos el vaso de precipitados, con el ácido y con dos gota de fenoltaleína, debajo de la bureta.

3. Abrimos la llave de la bureta y vamos dejando caer gota a gota su contenido.

4. Al mismo tiempo que van cayendo las gotas vamos moviendo energicamente en círculos el vaso de precipitado para ser lo más exactos posibles.

5. Cuando el contenido del vaso cambie de color por la fenoltaleína estaremos ante la neutralización del ácido entonces tomaremos como referencia para calcular la concentración del ácido la cantidad de base que hemos utilizado.

OBSERVACIONES

En nuestro caso hemos usado 23.6 mL de base, por lo que a través de la fórmula de la valoración nos llevó a la concentración del ácido: 0.47 M

Preparación de Soluciones para SDS-PAGE para Proteínas

• Calculamos la cantidad de SDS al 20% que necesitamos para el volumen deseado: 50mL 
• Pesamos el SDS en un vaso de precipitado, después añadimos agua hasta 170mL 
• Calentamos a 68ºC y agitamos con un agitador magnético.
• Cuando esté disuelto lo enrasamos a 200mL.
• Lo etiquetamos y lo guardamos a temperatura ambiente.

-TRIS-CIH 0.5M pH 6.8-200mL:

• Calculamos la cantidad de Tris que necesitamos para preparar 200mL.
• Pesamos el Tris en un vaso de precipitado, que hemos calculado que será: 12.11, añadimos hasta 170mL de agua destilada y agitamos con agitador magnético.
• Medimos el pH, que efectivamente marca 6.8
• Lo enrasamos a 200mL.
• Lo etiquetamos y lo guardamos a temperatura ambiente.

-RUNNING BUFFER FOR PROTEINS 10X-1 LITRO:

• Pesamos 27.26g de Tris y 144.86g de Glicina, junto con un volumen de de SDS 20% de 50mL 
• Todo lo añadimos a un vaso de precipitados añadiendo agua hasta unos 900 mL y agitamos con un agitador magnético.
• Medimos el pH que es 8.
• Lo enrasamos hasta 1L con agua destilada.
• Lo etiquetamos y guardamos a temperatura ambiente.

-RUNNING BUFFER FOR PROTEINS 1X-1 LITRO:

• Preparamos un litro de Running Buffer 1X a partir de Running Buffer 10X.
• Enrasamos en un matraz aforado hasta 1L con agua destilada.
• Lo etiquetamos y guardamos a temperatura ambiente.

-TCA:

• Pesamos 5g de TCA.
• Lo enrasamos en un matraz aforado hasta 50mL con agua destilada.
• Lo etiquetamos y guardamos a temperatura ambiente.

-LOADING BUFFER 5X FOR PROTEINS SAMPLE:

• Pesamos la Glicina y medimos el

Preparación de Disoluciones Tampón y Calibración del pH Metro

OBJETIVO

En esta práctica aprendemos a usar el pH Metro midiendo el pH de varias disoluciones y de paso nos vamos familiarizando con los ácidos y las bases.

MATERIAL

• pH-metro
• Vasos de precipitado
• Agua destilada
• Ácido clorhídrico
• Acetato sódico
• Ácido acético glacial

PROCEDIMIENTO

- Preparación de las disoluciones:

1. Calculamos la cantidad que necesitamos de ácido acético glacial y de acetato sódico.

2. Una vez calculamos vemos que el ácido acético glacial tenemos que coger 1.201mL que enrasaremos hasta 100 mL con agua destilasa y de acetato sódico 2.71g

- Calibración de el pH y medición:
1. Colocamos el pHmetro en una superficie adecuada y lo enchufamos.
2. Quitamos la cápsula que contiene la disolución de conservación.  
3. Limpiamos el electrodo y lo metemos en la solución de conservación calibradora y le damos al botón de calibrar.
4. Volvemos a limpiar el electrodo y comenzamos a medir los pH 
5. Entre una medición y otra iremos lavando el electrodo con agua destilada y a continuación lo secaremos, pero sin frotarlo.
6. El sistema de medida del pH debe estar funcionando durante al menos 30 minutos antes de iniciar el proceso de calibración, por lo que lo conectamos antes de comenzar la práctica.

7. Retiramos la tapa del electrodo, que contiene una disolución de Cloruro de Potasio para conservar el electrodo.

8. Limpiamos el electrodo y lo secamos sin frotar y lo sumergimos en la solución calibradora por dos veces para asegurarnos que las condiciones de pH del pH-metro son las óptimas.

9. Después de la calibración limpiamos el electrodo y lo secamos.

10. A continuación ponemos nuestro Hidróxido sódico en un vaso de precipitado, en el vaso añadiremos un mosquito por que vamos a usar un agitador magnético para mover la disolución conforme vamos añadiendo el ácido y que la medición del pH-metro sea lo más real posible.

11. Pues ya que tenemos preparado todo lo que respecta al vaso de precipitado introducimos el electrodo en la base y vamos añadiendo poco a poco gotas de ácido observando como va bajando el pH de la base.

OBSERVACIONES

Calibramos en un punto por que vamos a medir valores de pH cercanos al tampón usado.

Cuando al principio de la práctica añadimos un par de gotas de ácido el pH apenas varía, pero después al añadir agua baja bruscamente el pH.

Separación por Decantación y Centrifugación de Agua y Aceite

OBJETIVO

Adquirir conocimientos teoricos sobre el proceso de decantantación y centrifugación pero de forma muy visual.

MATERIAL

• Agua
• Aceite
• Tubo ependorff
• Pipeta pasteur
• Centrífuga
• Peso (para meter los tubos bien equilibrados los tubos en la centrífuga)

PROCEDIMIENTO

1. Añadimos en un ependorff agua y aceite a ojo, intentando que la cantidad de cada cosa sea equilibrada.

2. Dejamos reposar para poder observar su división en dos fases bien diferenciadas.

3. Después lo mezclamos con un vortex y lo centrifugamos.

4. Ahora que tenemos las  dos fases de nuevo bien separadas con una pipeta pasteur intentamos retirar de nuestro ependorff todo el aceite y dejar solo agua, pero con cuidado no llevarnos agua.

5. Cuando hallamos realizado la separación volvemos a centrifugar para comprobar que lo hemos hecho correctamente, observando que no aparezca aceite en el eppendorff.

OBSERVACIONES

Una mezcla de dos líquidos puede ser separada de varias formas, ya que como hemos podido comprobar al ser dos líquidos no miscibles tienen  tienen diferentes propiedades físicas como la densidad, ebullición, etc, lo que nos permite seleccionar el método de separación más adecuado. 

Filtración

OBJETIVO

Entender a través de una práctica el procedimiento de las operaciones de filtrado parándonos a comprender las propiedades que nos permiten realizar un filtrado.

MATERIAL

• Papel de filtro
• Filtro de membrana esterilizante
• Sistema de vacío (bomba de vacío)
• Embudo
• Vaso de precipitados o matraz elenmeyer
• Matraz Kitasato
• Disolución de agua y café
• Agua destilada
• Café
• Embudo Buchner
• Parafilm
• Sistema de vacío

PROCEDIMIENTO

- Filtro liso:

1. Dibujamos un círculo con papel de filtro, del tamaño de la boca de el embudo, para que se acople bien.

2. Colocamos el embudo en el matraz y ponemos el filtro que hemos hecho, lo humedecemos para que se adhiera un poco al embudo.

3. Vamos añadiendo la disolución de agua y café.

- Filtro con pliegues:

1. Como en el caso de filtro liso, recortamos el redondel para luego colocarlo en un embudo, pero esta vez dejaremos cierta anchura de más por que le vamos a hacer.
2.  Colocamos el embudo en el matraz y ponemos el filtro que hemos hecho, lo humedecemos para que se adhiera un poco al embudo.
3. Vamos añadiendo la disolución de cafe y agua.

- Filtración por vacío:
1. Preparamos el matraz Kitasato, acoplándolo al sistema de vacío a través de una goma, colocamos otro Kitasato, por si algo de líquido pasara por la goma que no llegue a la bomba y no se rompa.
2. El embudo Buchner se une al matraz con un tapón para impedir la entrada de aire y que funcione bien el vacío.
3. Colocamos el embudo Buchner con un filtro de membrana en el fondo y lo humedecemos.
4. Vamos añadiendo la disolución de cafe y agua.

OBSERVACIONES

Siempre que filtremos tenemos que tener en cuenta que hay que añadir la disolución lentamente para evitar que el filtro se colmate y que esto nos impida continuar con la filtración.

Cuando queremos filtrar más rápidamente usamos el filtro de pliegues debido a que tiene más superficie de filtrado.
En nuestro caso hemos puesto Parafilm cuando se trata de la filtración Kitasato en las uniones para evitar la entrada de aire, además aquí tenemos que tener especial cuidado a lla hora de no colmatar el filtro, ya que a parte de ser la filtración más rápida es la más propensa a colmatarse.
También es interesante decir que al realizar la filtración de el café al vacío y el agua se filtró previamente, ya que los granos de café son demasiado grandes para este tipo de filtros.